Wszechstronny modułowy system wektorowy do szybkiej kombinatorycznej genetyki ssaków

Tutaj opisujemy system wielokrotnej ekspresji lentiwirusowej (MuLE), który umożliwia wielokrotne zmiany genetyczne wprowadzane jednocześnie do komórek ssaków. Stworzyliśmy zestaw narzędzi wektorów MuLE, które stanowią elastyczny, modułowy system do szybkiej inżynierii złożonych lentiwirusów policistronowych, umożliwiający kombinatoryczną nadekspresję genu, knockdown genu, delecję genów za pośrednictwem Cre lub CRISPR / Cas9 (gdzie CRISPR wskazuje, że kumulacja jest regularnie przeplatana krótkie powtórzenia palindromowe), wraz z ekspresją fluorescencyjnych lub enzymatycznych reporterów do testów komórkowych i obrazowania zwierząt. Przykłady inżynierii nowotworów wykorzystano do zilustrowania szybkości i wszechstronności wykonywania kombinatorycznych genetyki przy użyciu systemu MuLE. Poprzez transdukcję hodowanych pierwotnych komórek mysich za pomocą pojedynczych lentiwirusów MuLE, opracowaliśmy guzy zawierające do 5 różnych zmian genetycznych, zidentyfikowaliśmy zależność genetyczną molekularnie zdefiniowanych nowotworów, przeprowadziliśmy ekrany badań genetycznych i indukowaliśmy jednoczesny supresor supresorowy nowotworu oparty na CRISPR / Cas9. geny. Wstrzyknięcie domięśniowe wirusów MuLE eksprymujących onkogenny H-RasG12V w połączeniu z kombinacjami supresorów supresorów nowotworów, kinazowego inhibitora kinazy 2A (Cdkn2a), białka 53 związanego z transformacją (Trp53) oraz fosfatazy i homologu tensyny (Pten) umożliwiło generowanie 3 modele mysiego mięsaka, pokazujące, że genetycznie zdefiniowane guzy autochtoniczne można szybko generować i monitorować ilościowo przez bezpośrednie wstrzyknięcie policystycznych lentiwirusów MuLE do mysich tkanek. Wspólnie, nasze wyniki pokazują, że system MuLE zapewnia genetyczne moce do systematycznego badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób ludzkich. Wprowadzenie W badaniu wielu procesów biologicznych często pożądana jest możliwość jednoczesnego manipulowania wieloma genami. Dobrym przykładem jest modelowanie nowotworów u myszy. Zastosowanie technologii genomowych w badaniach nad rakiem zrewolucjonizowało nasze rozumienie genetycznych krajobrazów nowotworów (1, 2); jednak niezbędne są badania funkcjonalne, aby zrozumieć te wysiłki katalogowania, aby określić, w jaki sposób różne kombinacje wielu potencjalnych mutacji genetycznych dyktują fenotypy nowotworów i aby dostarczyć dokładne modele, które można zastosować w badaniach przedklinicznych w celu zidentyfikowania specyficznych dla mutacji terapii. Techniki manipulacji genetycznych w linii germańskiej pozwoliły na generowanie linii myszy, w których geny mogą być usunięte, zmutowane, wyciszone lub nadmiernie eksprymowane w specyficznych czasowych i typowych dla komórek typach (3). Te podejścia dostarczyły wielu wglądu w rozwój i progresję raka; jednak generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy i ich krzyżowanie w celu wytworzenia złożonych mutantów są czasochłonnymi i kosztownymi procesami. Ponadto, modelowanie nowotworów ex vivo przy użyciu komórek pierwotnych jest często komplikowane przez ograniczony okres, w którym można hodować te komórki i brak odpowiednich narzędzi genetycznych, które umożliwiają jednoczesne wprowadzanie wielu zmian genetycznych do tych komórek. Obecne podejścia polegające na dostarczaniu genów mające na celu wprowadzenie wielu zmian genetycznych za pomocą wektorów plazmidowych lub wirusowych często wymagają uciążliwych metod klonowania w celu wygenerowania skomplikowanych multicistronowych konstruktów wektorowych i / lub wielu rund transfekcji lub transdukcji i wymagają wprowadzenia wielu markerów selekcyjnych w celu identyfikacji i wyizolowania odpowiednich komórki. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy system wielokrotnej ekspresji lentiwirusowej (MuLE) oparty na klonowaniu bramek MultiSite (4) i umożliwiający łatwe i elastyczne generowanie policistronowych, niekompetentnych lentiwirusów ekotropowych lub amotropowych
[przypisy: objawy chłoniaka, nowotwór płuc objawy, olx krapkowice ]