przychodnia vivamed warszawa

Transdukcja ludzkich komórek czerniaka A-375 wykazała, że wirusy Mule wyrażające białka iRFP lub lucyferazy umożliwiają ilościowe monitorowanie obciążenia nowotworem w eksperymentach z ksenoprzeszczepami (Suplementalna Figura 5). Inżynieria genetycznie złożonych guzów z komórek pierwotnych przy użyciu pojedynczych wirusów MuLE. Aby zademonstrować użyteczność systemu MuLE w modelowaniu raka, przeprowadziliśmy eksperymenty w MEF wykazujące, że pojedynczy wirus może reprodukować kilka fenotypów, o których wiadomo, że są wynikiem genetycznej współpracy między onkogenami a genami supresorowymi dla guza. Nadekspresja onkogennej formy H-Ras (G12V) w połączeniu z utratą funkcji p53 powoduje transformację komórki (9, 10). Uzyskaliśmy tryicystronowy lentiwirusowy wektor ekspresyjny zaprojektowany do jednoczesnej ekspresji białka SHRNA miR-30 przeciwko białku 53 związanemu z transformacją (Trp53) i ekspresji onkogennej H-RasG12V i oporności na puromycynę (Figura 4A), jak również wirusom kontrolnym nie wyrażającym ani jednego, ani tylko jednego z nich. elementy. Analiza Western blot pierwotnych MEF wybranych przez puromycynę wykazała oczekiwane porażenie p53 i nadekspresję H-RasG12V (Figura 4B), a testy transformacji wykazały, że sam knokowanie Trp53 umożliwiło tworzenie kolonii po wysianiu w niskiej gęstości (Figura 4C), ale ta strata hamowania kontaktowego (tworzenie ognisk) i wzrostu niezależnego od zakotwiczenia zachodziło tylko w komórkach z jednoczesnym knockdown Trp53 i nadekspresją H-RasG12V, zgodnie z oczekiwaniami (Figura 4, D. F). Podobnie, użycie pojedynczego wektora MuLE do jednoczesnego strącenia Trp53 i nadekspresji Myc (Figura 4, G i H) umożliwiło wzrost komórek o niskiej gęstości (Figura 4I) i odtworzenie znanego efektu utraty funkcji Trp53 w ratowaniu Myc- indukowana apoptoza w MEF (odnośnik 11 i Figura 4J). Figura 4 Genotypy rekombinacyjne za pomocą wektorów MuLE. (A) Wektorem lentiwirusowym do jednoczesnego stłumienia Trp53 i nadekspresji onkogennego H-RasG12V. (B) Analiza Western blot pierwotnych MEF transdukowanych wskazanymi lentiwirusami. (C) Barwienie fioletem krystalicznym tych samych komórek 14 dni po zaszczepieniu przy niskiej gęstości i (D) 14 dni po wysianiu w teście ogniskowania. (E) Reprezentatywne obrazy tych samych komórek wysianych w teście na miękką agarową agarę po 3 tygodniach wzrostu. Paski skali: 200 .m. (F) Kwantyfikacja ognisk i kolonii rosnących w testach z wektora L i E. (G) Lentiwirusa generowanego do jednoczesnego strącenia Trp53 i nadekspresji Myc. (H) Analiza Western blot pierwotnych MEF transdukowanych wskazanymi lentiwirusami. (I) Barwienie fioletem krystalicznym tych samych komórek 14 dni po wysianiu przy niskiej gęstości. (J) Kwantyfikacja żywych komórek 3 dni po transdukcji wskazanymi lentiwirusami. Wszystkie wykresy przedstawiają średnią. SD. Test ucznia, n = 3. ** P <0,01; *** P <0,001. Aby jeszcze bardziej udowodnić użyteczność naszego systemu w modelowaniu nowotworów, wygenerowaliśmy wektor multicistronowy zaprojektowany do usuwania Trp53, nadekspresji H-RasG12V z indukowalnego promotora CMV / TO i ekspresji iRFP w celu umożliwienia monitorowania rozwoju nowotworu (Figura 5A). Bakterie oporne na blastycydynę po zakażeniu pLenti-CMV-TetR-Blast (6) transdukowano wektorem MuLE i wyselekcjonowano puromycyną. Analiza Western blot wykazała konstytutywne knockdown p53, ale nadekspresja H-RasG12V wystąpiła tylko po indukcji DOX (Figura 5B). Komórki te rosły skutecznie jako guzy po wstrzyknięciu podskórnym myszom SCID / beżowym z obniżoną odpornością tylko po dodaniu DOX do wody pitnej (Figura 5, C = E), co pokazuje, że wektory MuLE można stosować do generowania regulowalnych i ilościowo monitorowanych modeli opartych na nowotworach. o kooperacyjnych interakcjach genetycznych. Figura 5 Genetyka rekombinacyjna z zastosowaniem indukowalnych wektorów MuLE [podobne: olx puck, objaw lasegue, olej z wiesiolka ]