nawigacja android rower

We wszystkich panelach attA i attB oznaczają, że dla tych wektorów dostępnych jest wiele kombinacji miejsc attL-attR bram Gateway. (I) Schematyczne przedstawienie wektorów docelowych zmodyfikowanych z serii pLenti X1 w celu zawarcia różnych pokazanych kaset ekspresyjnych. (J) Kwantyfikacja (średnia . SD) wydajności rekombinacji n niezależnych rekombinacji attL-attR w bramce MultiSite przy użyciu 2, 3 lub 4 wektorów MuLE Entry. Podczas gdy system MuLE jest kompatybilny z amfoterycznym białkiem otoczki VSV-G (Suplementowa Figura 5 pokazuje przykład), z powodów związanych z bezpieczeństwem biologicznym, wszystkie lentiwirusy stosowane do transdukcji mysich komórek w tym badaniu były pseudotypowane ekotropowym białkiem otoczki z wirusa białaczki mysiej Moloneya. który został opisany jako umożliwiający lentiwirusową infekcję mysich fibroblastów i komórek krwiotwórczych, ale nie komórek ludzkich (7, 8). Pomimo oczywistych zalet związanych z bezpieczeństwem biologicznym, ta koperta znalazła zaskakująco małe zastosowanie w laboratoriach badawczych. Następnie zbadaliśmy tropizm komórkowy lentiwirusów MuLE pseudotypowanych tą kopertą i odkryliśmy, że zakażają one różne hodowane komórki pierwotne, w tym mysie zarodkowe fibroblasty (MEF), embrionalne komórki macierzyste, komórki nabłonkowe nerek, komórki nabłonka endometrium, hepatocyty i śródbłonek aorty. komórki, jak również unieśmiertelnione linie komórkowe mioblastów, czerniaka, raka płuc i raka jelita grubego, ale nie były zdolne do zakażenia kilku ludzkich linii komórkowych, w tym 786-O, 293T (Figura 3A), HeLa i MCF-7 (dane nie pokazane ). Ekspresja genu swoistego dla typu komórkowego jest również możliwa przy użyciu wektorów MuLE. Klonowanie EGFP poniżej promotora Ksp1.3 specyficznego dla nabłonka nerkowego specyficznego w wektorze Mule (Figura 3B) umożliwiło ekspresję EGFP w komórkach nabłonka nerkowego, ale nie w MEF (Figura 3C). W ten sposób ekotropowe wirusy MOL mogą infekować szerokie spektrum docelowych komórek i mogą być wykorzystane do indukowania ekspresji genów w specyficzny sposób typu komórki. Figura 3 Tropizm komórkowy komórki i swoista dla typu komórki ekspresja ekotropowych wektorów MuLE. (A) Obrazowanie luminescencyjne różnych ludzkich i mysich hodowanych komórek po infekcji ekotropowymi wirusami MuLE wyrażającymi pustą kasetę (Ctrl) lub lucyferazę (Luc). Ludzkie linie komórkowe nerki 293T i 786-0 nie zostały zainfekowane przez te wirusy, ale zainfekowano różne pierwotne komórki mysie i linie komórkowe, w tym MEF, embrionalne komórki macierzyste (ES), komórki nabłonkowe nerek (KEC), komórki nabłonka endometrium (EEC ), komórki śródbłonka aorty (AEC), hepatocyty (Hep), mioblasty (C2C12), komórki czerniaka (B16), komórki raka płuca (LLC-1) i komórki raka okrężnicy i odbytnicy (MC-38). (B) Schemat wektorów MuLE z lub bez specyficznego dla nabłonka nerkowego specyficznego promotora Ksp1.3 sklonowanego powyżej cDNA kodującego EGFP. (C) Reprezentatywny obraz z jasnym polem (BF) i zieloną fluorescencją (EGFP) pierwotnych komórek nabłonkowych nerki myszy (PKC) i pierwotnych MEF transdukowanych wektorami lentiwirusowymi pokazanymi w B. Oryginalne powiększenie, x (A); × 10 (C). Aby zweryfikować funkcjonalność wektorowego zestawu narzędzi do genetycznej manipulacji komórek pierwotnych, przeprowadziliśmy serię eksperymentów obejmujących transdukcję podstawowych czynników MEF. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie doświadczenia w tej publikacji przeprowadzono przy MOI wynoszącym 1. Te badania walidacyjne wykazały, że wektory MuLE są zdolne do: (a) indukowania knockdown pośredniczonego przez shRNA z różnych promotorów pol III (dodatkowa Figura 3, A. DO); (b) indukowanie równoczesnych knockdownów podwójnego genu z pojedynczego wektora w sposób, w którym siły knockdownów są niezależne od kolejności kaset knockdown w wektorze (dodatkowa Figura 3, D i E) i są równoważne z zakresem knockdownów uzyskanych z wektorów eksprymujących pojedyncze shRNA (dodatkowa Figura 3, F i G); (c) indukującego knockdown konstytutywnego shRNAAIR-30 . konstytutywnego (Suplementowa Figura 3, Hj.J) i indukowalnego (Suplementowa Figura 3, K .M); (d) indukowanie indukowalnej tamoksyfenem delecji genu pośredniczonej przez Cre-ERT2 (Suplementowa Figura 4, A i B); i (e) indukowanie równoczesnej ekspresji 2 shRNA, 2 cDNA i genu oporności na lek z 5 różnych kaset ekspresyjnych w pojedynczym wektorze (Suplementowa Figura 4, C. E)
[hasła pokrewne: olej z wiesiolka, objawy chłoniaka, numer statystyczny choroby ]