logopeda oleśnica nfz

Wcześniej doniesiono o analizach histologicznych (39) i immunocytochemii FAH (15). Obrazy całych fragmentów tkanek zostały połączone razem przy użyciu oprogramowania AxioVision 4.7 (Carl Zeiss) z poszczególnych płytek uzyskanych w kolorowej kamerze Zeiss MRc zamontowanej na serwerze Zei AxioObserver z sterowaniem stopniowym z silnikiem. Karyotypes. Najpierw świeżo wyizolowane hepatocyty pierwotne zaszczepiono w ilości 5000 7 7500 komórek / cm2 na plastrze do hodowli tkanek Primaria (BD) i inkubowano w DMEM / F12 (Invitrogen), 0,5% FBS (Hyclone), suplement ITS (zawiera 5 .g / ml insuliny 5 mg / ml transferyny i 5 ng / ml selenianu sodu, Invitrogen), 15 mM HEPES i antybiotyk-środek przeciwgrzybiczy (Cellgro). Po 4 godzinach komórki przemyto jeden raz DMEM / F12 w celu usunięcia nieprzylegających komórek i dostarczono świeżą pożywkę hodowlaną uzupełnioną 50 ng / ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (Invitrogen) i 1,0. M 3,3., 5-Triiodo-L-tyroniny sól sodowa (T3) (Sigma-Aldrich). Po drugie, po około 40 godzinach, hepatocyty potraktowano 30 ng / ml KaryoMax Colcemid Solution (Invitrogen) przez 3 godziny i zebrano przez trypsynizację. Po trzecie, po intensywnym przemywaniu komórki inkubowano przez 15 minut w 75 mM KCl i utrwalono za pomocą mieszaniny metanol / kwas octowy (stosunek 3: 1). Na koniec, chromosomy z około 20 hepatocytów zatrzymanych w metafazie na próbkę były pasemkami G ze standardowym protokołem barwnym trypsyna / Wright. S. Zdjęcia zostały wykonane przy użyciu oprogramowania CytoVision firmy Applied Imaging. Array CGH. Genomowy DNA z próbek hepatocytów i splenocytów izolowano przy użyciu zestawu DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN). Macierz CGH została wykonana przy użyciu mikromacierzy Agilent 180K SurePrint G3 Mouse (nr kat. G4826A-027411, NCBI Build 37) z ogólną przestrzenną odległością sond 1,8 kb. Trawienie DNA, znakowanie i hybrydyzację przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, z niewielkimi modyfikacjami, jak opisano (40). W skrócie, .g genomowego DNA z testu (tj. Hepatocytów) i .g referencyjnych (tj. Splenocytów) próbek trawiono AluI i RsaI (Promega) w 37 ° C przez 2 godziny i znakowano cyjaninem 5-dCTP. (dla badanej próbki) lub cyjaninowej 3-dCTP (dla próbki odniesienia) (PerkinElmer) w 37 ° C przez 2 godziny przy użyciu modułu do znakowania CGH Bioprime (Invitrogen). Oznaczone DNA próbek testowych i niezgodne z płciami pliki obrazów mikromacierzy zostały określone ilościowo za pomocą oprogramowania Agilent Feature Extraction (wersja 9.5), a wyniki plików tekstowych zostały zaimportowane do oprogramowania Agilent Genomic Workbench (wersja 6.5). Aby zidentyfikować aneuploidię chromosomalną i genomowe warianty liczby kopii, dane analizowano za pomocą algorytmu statystycznego 2 metody detekcji aberracji (ADM2), który wykorzystuje procedurę iteratywną do identyfikacji wszystkich regionów genomowych, dla których ważony średni stosunek log2 mierzonych sygnałów sondy jest różny od oczekiwanej wartości 0 o więcej niż dany próg. . Fuzzy Zero. i. Centralizacja. wykorzystano domyślne algorytmy DNA Analytics. Aby zminimalizować wykrywanie nieistotnych wariantów, analizy danych przeprowadzono z użyciem progu 6,0 i odfiltrowano zmiany wykryte przez mniej niż 150 sond (<300 kb). Dane analizowano również za pomocą ADM2 z progiem 3.0 i stosując algorytm ADM1 z lub bez filtrów, które nie wykryły dodatkowego mozaikowatości niskiego poziomu aneuploidii. Surowe pliki danych (GEO GSE38963) są dostępne za pośrednictwem GEO. Statystyka. Istotność statystyczną (fig. 2D) określono przy użyciu dwustronnego testu ucznia. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za znaczące. Analiza statystyczna danych aCGH została opisana powyżej. Zatwierdzenie badania. Komitet ds. Instytucji i Opieki nad Zwierzętami w Oregon Health and Science University zatwierdził wszystkie eksperymenty na myszach. Materiały uzupełniające Zobacz dodatkowe dane Podziękowania Podziękowania dla firmy S Kaech Petrie (Advanced Light Microscopy Core w Oregon Health and Science University, dotacja podstawowa S10-RR023432), G. Banker za użycie mikroskopu Zeiss AxioObserver i A. Major (Morfologia rdzenia w Texas Medical Center, grant DK56338) w histologii wsparcie. Jesteśmy wdzięczni J. Colemanowi, A. Haftowi i S. Nygaard za fachowe zarządzanie kolonią myszy i laboratorium. Praca ta była wspierana przez granty od NIH do M. Grompe (DK048252) i AW Duncan (F32DK076232). Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2012; 122 (9): 3307. 3315. doi: 10,1172 / JCI64026. [więcej w: nowotwór wątroby, odma prężna, olejek z wiesiołka ]