kokos suszony

Promotorowe wektory zawierające tylko MCS oflankowane przez różne kombinacje miejsc attL-attR (Figura 2C) reprezentują elastyczne elementy, które ułatwiają generowanie różnych typów złożonych konstruktów wektorowych. Wygenerowaliśmy wektory wejściowe, aby umożliwić ekspresję kierowanego przez U6 promotora krótkiego przewodnika RNA (sgRNA) dla mediowanego przez CRISPR / Cas9 (gdzie CRISPR wskazuje na klastrowane regularne krótkie powtórzenia palindromowe) mutację genu (figura 2D). Wektory wejściowe z 3 różnymi konstytutywnymi promotorami pol III (U6, 7SK, H1) pozwoliły na ekspresję shRNA (Figura 2E). W celu konstytutywnej ekspresji shRNA w formacie microRNA-30 (miR-30), wygenerowaliśmy wektory wejściowe oparte na plazmidzie pSM2 (5), który obejmuje 5. i 3. sekwencje flankujące z miR-30 kierowane przez promotory U6, 7SK lub H1 pol III (Figura 2F). Indukowany DOX wektor genowy knockdown został wygenerowany przy użyciu promotora CMV / TO do kierowania ekspresją shRNAAroR-30 (Figura 2G). Oprócz tych elastycznych wektorów do klonowania, stworzyliśmy kilka gotowych do użycia wektorów wejściowych zawierających cDNA dla hCas9, białek fluorescencyjnych (EGFP, mCherry, białko fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni [iRFP], tdTomato), enzymatyczne reportery (lucyferaza, lacZ), lekooporność (puromycyna) i indukowalną tamoksyfenem rekombinazę Cre (Cre-ERT2) (Figura 2H). Aby umożliwić wysoki stopień elastyczności w łączeniu różnych liczb i typów wektorów wejściowych przez klonowanie rekombinacyjne, większość opisanych wektorów jest dostępnych z wieloma kombinacjami różnych miejsc attL-attR (Tabele dodatkowe i 2). Rozszerzyliśmy nasz zestaw narzędzi wektorowych, generując serię lentiwirusowych wektorów docelowych na podstawie modyfikacji wcześniej opisanego wektora pLenti X1-Puro-DEST (6), umożliwiając oznaczanie komórek odpornością na lek (puromycynę, neomycynę) lub różnymi fluorescencyjnymi (EGFP, iRFP, IFP1.4) lub luminescencyjne (lucyferaza) białka (Figura 2I) w celu ułatwienia testów komórkowych, jak również badań obrazowania żywych zwierząt. Przeprowadziliśmy liczne reakcje rekombinacji z układem MuLE i odkryliśmy, że około 90%, 65% lub 25% wszystkich kolonii bakteryjnych wyizolowanych z rekombinacji z udziałem odpowiednio 2, 3 lub 4 wektorów wejściowych zawierało pożądany produkt (Figura 2J). Tak więc, wysoce skomplikowane, wielostronne wektory ekspresyjne MuLE można z łatwością sklonować. Te złożone wektory mogą być stabilnie replikowane w bakteriach i nie wykazują żadnych dowodów na niepożądaną rekombinację genetyczną (Suplementowa Figura 1). Podobnie jak w przypadku wszystkich wektorów lentiwirusowych, istnieje odwrotna zależność między wielkością prowirusa MLE a miana generowanego wirusa, z prowirusami do 7,5 kb, dającymi miana około 106 CFU / ml i bardzo duże (12,5 kb) prowirusy dające miana. około 103 CFU / ml (dodatkowa Figura 2). Wszystkie te wektory zostały zdeponowane w Addgene i można je uzyskać pojedynczo lub jako zestaw 96-wektorowy. Numery referencyjne Addgene dla każdego wektora znajdują się w Tabelach dodatkowych i 2. Rysunek 2 Zestaw narzędzi wektorowych MuLE. (A i B) Mule Wektory wejściowe dla ekspresji konstytutywnej promotor pol II (A) lub ekspresji indukowalnej DOX (B). (C) Promotorowe wektory wprowadzania MuLE. (D) Mule Wektory wejściowe dla ekspresji sgRNA sterowanej przez U6. (E i F) Mule Wektory wejściowe do knockdown (F) na bazie shRNA (E) i shRNA ayrR-30a (F) przy użyciu promotorów pol III i (G) indukowalnego na podstawie DOX wektora ekspresyjnego shRNA opartego na miR-307. Przedstawiono miejsca enzymów restrykcyjnych do klonowania. (H) Schematyczne przedstawienie wektorów MuLE Entry do ekspresji hCas9, białek fluorescencyjnych (EGFP, mCherry, iRFP, tdTomato), świetlika-lucyferazy, (3-galaktozydazy (LacZ), oporności na puromycynę lub Cre-ERT2
[przypisy: nowotwór płuc objawy, numer statystyczny choroby, objaw lasegue ]