ginekolog nfz warszawa bielany

Supernatant IFN-. (słupki) i wewnątrzkomórkowe RNA HAV (czerwona linia) są pokazane. GE, odpowiedniki genomu. (G) pDC i komórki zakażone HAV hodowano razem z lub bez rozdzielania przepuszczalną błoną (wielkość porów = .m). Dane reprezentują średnią. SEM w A, B i D. G. IFN-. produkcję zlikwidowano przez współhodowanie pDC z zakażonymi komórkami Huh-7,5 w obecności chlorochiny lub bafilomycyny A1 (Figura 1D, w środku), co sugeruje konieczność zakwaszenia endosomalnego. Zgodnie z tym, inhibitor specyficzny dla TLR7, IRS-661, ale nie oligonukleotyd kontrolny, znacząco zablokował IFN-y. produkcja (rysunek 1D). Potwierdziliśmy, że pDCs są odpowiedzialnymi typami komórek, wykazując wyraźną redukcję IFN-y wytwarzanie, gdy obwodowe jednojądrzaste komórki zostały pozbawione komórek BDCA4 + przed wspólną hodowlą z zakażonymi komórkami (Figura 1E). IFN-. wytwarzanie korelowało również z liczebnością RNA HAV w zakażonych komórkach (Figura 1F). Co ważne, pDC stymulowano tylko wtedy, gdy znajdowały się w bliskim sąsiedztwie komórek zakażonych HAV, a nie w przypadku oddzielenia przepuszczalną błoną (Figura 1G). Odkrycia te są równoległe do obserwacji z HCV (21) i sugerują, że słaba wewnątrzwątrobowa odpowiedź ISG obserwowana w ostrym zapaleniu wątroby typu A (12) nie wynika z niezdolności pDC do wykrywania komórek zakażonych HAV. Wirowane wiriony eHAV pośredniczą w aktywacji pDC. Ponieważ wysoko stężone preparaty nie wytworzonych wirionów nie stymulują pDC, prawdopodobnie IFN-y wytwarzane przez pDC, gdy są hodowane wspólnie z zakażonymi komórkami, odzwierciedlają wykrywanie otoczonych wirionów. Alternatywnie, RNA HAV można przenieść do pDC jako ładunek w obrębie egzosomów uwalnianych przez zakażone komórki, zgodnie z propozycją dla HCV (22). Zgodnie z każdą z hipotez 100-krotne stężenie supernatantów z zainfekowanych komórek zawierających głównie otoczone cząstki eHAV stymulowało pDC do wytwarzania IFN-y. (Figura 2A). Aby rozwiązać materiał aktywujący, poddaliśmy skoncentrowane płyny hodowli komórkowej ultrawirowaniu w gradientach jodopiknowych jodiksanolu, aby oddzielić otoczone i nierozwinięte wiriony (11). Zidentyfikowaliśmy wiriony we frakcjach gradientowych za pomocą RT-qPCR specyficznego dla RNA HAV i wykorzystaliśmy test enzymatyczny do śledzenia acetylocholinoesterazy (AChE), która jest obecna na błonach eksomów (25, 26). Aktywność AChE osiąga wartości szczytowe we frakcjach o gęstości ~ 1,12 g / cm3 (frakcja 16), w przeciwieństwie do eHAV, które pasywało się przy ~ 1,08 g / cm3 (frakcja 13) (Figura 2B). Nasze poprzednie badania wykazały, że programowane białko oddziałujące z komórką 6 (ALIX, znane również jako PDCD6IP), białko związane z ESCRT, zaangażowane w biogenezę zarówno exosomów, jak i eHAV, prążki w 2 różnych szczytach przy tych gęstościach w podobnych gradientach (11, 27). Co godne uwagi, podczas inkubacji z pDC, frakcje najbardziej efektywnie wyzwalają IFN-y. produkcja zawierała eHAV (rysunek 2B). Ponadto wielkość IFN-y wyprodukowano silnie skorelowane z obfitością RNA eHAV (Figura 2C), co wykazała analiza Northern blot w przeważającej części długości genomu (Figura 2D). Podsumowując, dane te sugerują, że eHAV, a nie egzosomy zawierające fragmenty RNA HAV, odpowiadają za większość aktywacji pDC. W celu dalszego rozwiązania aktywności stymulującej pDC, frakcje gradientu izopikenowego zawierające eHAV poddano drugiej rundzie wirowania w gradiencie stopni-stref (25). Pozwoliło to na rozdzielenie na podstawie wielkości i prędkości sedymentacji, a nie gęstości. Aktywność AChE, która pokrywała się z eHAV w gradientach izopikenowych, osadzała się wolniej niż eHAV w gradientach strefowo-zonowych, osiągając maksimum w ułamkach 2. 4, a nie w frakcjach 7. 9 (Figura 2E). ALIX był obecny w obu frakcjach błony, podczas gdy flotylina-1, która jest związana z eHAV, jak również egzosomami (11), wykryto tylko we frakcjach eHAV (Figura 2E)
[więcej w: olej z nasion wiesiołka, olejek z wiesiołka, objaw lasegue ]