diagter swarzędz piaski lekarze

W przypadku TEM ultracienkie skrawki wizualizowano w mikroskopie elektronowym FEI / Phillips CM-20. Usuwanie wosku, zastosowanie IMQ i iniekcja IL-22. Myszy znieczulono stosując ketaminę (100 mg / kg) i ksylazynę (10 mg / kg) przed goleniem tylnej skóry za pomocą elektrycznych maszynki do strzyżenia. Nakładano paski woskowe pokrywające obszar ogolenia, a następnie ściągano (3 paski na mysz). Nierozcieńczony 5% IMQ (Aldara) lub IMQ rozcieńczony over-the-counter kremem do skóry (stężenia końcowe, 1% i 0,25%) stosowano codziennie przez 3. 6 dni (0,625 mg / mysz / d). Przeciwciało anty-IL-22 wstrzyknięto (500 .g) ip dzień przed zastosowaniem IMQ. Ekstrakcja RNA. Tkankę zebrano, a część naskórkową oddzielono od części skóry przy użyciu rozcieńczenia 1: 3 dispazy (Stem Cell Technologies, nr katalogowy 07913) w 37 ° C przez godzinę. Naskórek został następnie poddany lizie w TRIzolu, a następnie ekstrakcji chloroformem i oczyszczeniu RNA z fazy wodnej przy użyciu zestawu Mini Pure Ambink Pure RNA zgodnie z protokołem producenta. Stężenie i jakość RNA określono ilościowo na NanoDrop. Analiza mikromacierzy. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z duplikatami biologicznymi, jak opisano uprzednio (35), z tym wyjątkiem, że zastosowano macierze Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST i przemyto zgodnie z zaleceniami producenta (Affymetrix). DEG zanalizowano za pomocą Cyber-T (72) i uznano za znaczące dla wartości P mniejszych niż 0,01 (w analizie publicznie dostępnej ludzkiej łuszczycy zastosowano zgięcie z fałdem. 1,5). Analizę Gene Ontology przeprowadzono dla wszystkich zestawów danych przy użyciu DAVID. Omawiane tutaj dane dotyczące mikromacierzy zostały zdeponowane w GEO (nr dostępu GSE59384). Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym. W celu analizy ekspresji mRNA, cDNA przygotowano przy użyciu zestawu cDNA iScript (Biorad Laboratories), a RT-PCR wykonano przy użyciu mieszanek głównych SsoFast EvaGreen (Biorad Laboratories) w systemie CFX384 Real-Time PCR Detection (Biorad Laboratories). P-Atynę stosowano jako kontrolę endogenną (patrz dodatkowa tabela 8 dla sekwencji starterów). Testy ChIP. Testy ChIP z przeciwciałami GRHL3 przeprowadzono i analizowano, jak opisano wcześniej (35). Epidermę zebrano dla ChIP w taki sam sposób jak dla izolacji RNA; wzbogacenie obliczono powyżej kontroli kontrolnej IP IgG (Sigma-Aldrich, nr katalogowy 15006-10MG) i znormalizowano do regionu genomowego kontroli negatywnej (patrz Tabela uzupełniająca 8 dla sekwencji starterów). ChIP-Seq. Biblioteki sekwencjonujące wygenerowano dla GRHL3 i próbek wejściowych, jak opisano wcześniej (35), stosując odczynniki NEB Next i adaptery Illumina i oligonukleotydy. 50-cyklowe jednokrotne sekwencjonowanie przeprowadzono na analizatorze genomu Illumina Hi-Seq 2000, a wynikowe odczyty wyrównano za pomocą Bowtie (73), zachowując tylko jednoznacznie wyrównane odczyty. Szczyty zostały wywołane za pomocą MACS (74), a dalszą analizę przeprowadzono za pomocą Galaxy. Dane ChIP-Seq omówione tutaj zostały zdeponowane w GEO (nr dostępu GSE52648). Statystyka. Dla wszystkich wykresów słupkowych dane są prezentowane jako średnie. SEM. Dla wszystkich boksu i boków boków pola boków odpowiadają zakresowi międzykwartylowemu (IQR), linie w polach oznaczają medianę, a wąsy oznaczają wartości maksymalne i minimalne (chyba że wskazano inaczej). W przypadku nakładania się ekspresji genów istotność oceniono za pomocą hipergeometrycznego obliczenia wartości P. W przypadku nakładania się ChIP-Seq istotność oceniano za pomocą HOMER (56), który wykonuje rozkład hipergeometryczny na podstawie objętej pikami. Aby przetestować istotność nakładania się ChIP-Seq i DEG z mikromacierzy, wzięliśmy 100 losowych tasowań plików szczytowych ChIP-Seq, związanych z każdym pikiem z jego najbliższym genem i oceniliśmy znaczenie nakładania się DEG przez oszacowanie parametrów rozkład normalny i obliczanie wyniku az obserwowanego nakładania się DEG, który został przetestowany pod kątem istotności przy. <0,05 [więcej w: nowotwór wątroby, objawy chłoniaka, numer statystyczny choroby ]