badania przy dnie moczanowej

Frakcje zbierano od wierzchołka gradientu, a gęstość każdego oznaczano za pomocą refraktometru Bausch & Lomb Abbé. Wirowanie z zastawką strefową. Próbki naniesiono na wstępnie przygotowany gradient 6% -18% jodiksanolu i odwirowano przy 250 000 gw rotorze SW55Ti przez 2 godziny w 4 ° C w ultrawirówce Beckman. Z góry gradientu zebrano około 10 frakcji. Test enzymatyczny na aktywność AChE. Aktywność AChE zmierzono zgodnie z wcześniejszym opisem (25). Pokrótce, 50. L ogrzanych frakcji gradientowych zmieszano z 50. L buforu do reakcji zawierającego 1,25 mM acetylotiocholiny i 0,1 mM 5,5-ditiio-bis (kwasu 2-nitrobenzoesowego), a OD412 określono w 30-sekundowych przedziałach w okresie czasu. 10 minut za pomocą czytnika mikropłytek Synergy 2 (BioTek). Test RT-qPCR specyficzny dla HAV. Całkowity RNA z komórek i supernatantów hodowli lub frakcji gradientu ekstrahowano odpowiednio zestawem RNeasy Kit i zestawem do izolacji wirusowego RNA QIAamp (Qiagen). RNA HAV mierzono za pomocą ilościowej PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) z syntetycznym RNA jako wzorami, jak opisano wcześniej (12). Wewnątrzkomórkowe wirusowe RNA normalizowano do poziomu całkowitego RNA. Pośrednie barwienie immunofluorescencyjne dla BDCA2. Zarchiwizowane, utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie próbki wątroby z szympansów zakażonych HAV 4×0293 i 4×0395 (12) zebrano przed 15 grudnia 2011 r. Sekcje traktowano kolejno ksylenem, 100% etanolem, 95% etanolem i 70% etanolem, a następnie pobieranie antygenu przez gotowanie przez 15 minut. Następnie, sekcje utrwalono 4% paraformaldehydem i permeabilizowano za pomocą 0,5% Triton-X 100, a następnie wybarwiono stosując zestaw do amplifikacji sygnału Tyramide (Invitrogen) zgodnie z zaleceniami producenta. Poliklonalne i monoklonalne przeciwciała anty-BDCA2 (45) zastosowano do wybarwienia pDC (patrz legenda dla Figury 4). Jako przeciwciała drugorzędowe zastosowano sprzężone przeciw koziemu lub anty-mysimi przeciwciała Alexa Fluor 488 (3 (Invitrogen). Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu odwróconego Nikon Eclipse Ti-s z oprogramowaniem do akwizycji NIS-Elements BR 3.10. Liczbę komórek BDCA2 + na 103 komórek nukleinowych dodatnich DAPI określono metodą półautomatyczną z użyciem oprogramowania Metamorph 7.1 (Molecular Devices). Średnia liczba zliczonych komórek jądrzastych na polu mikroskopowym wynosiła 1,717. 444 SEM. Luminex. Analizę Luminex dla cytokin plazmatycznych i chemokin przeprowadzono w laboratorium Immunology Core Laboratory w Southwest National Primate Research Center pod nadzorem Core Director Luisa Giavedoni. Próbki krwi zbierano w probówkach zawierających EDTA, a cytokiny i chemokiny mierzono w teście 39-pleksowym, stosując Luminex100 z platformą multianalitu xMAP (Millipore). Statystyka. Korelacje oceniano za pomocą metody nieparametrycznej Spearmana. Obliczenia zostały wykonane przy użyciu Prism 6 dla Mac OS X (oprogramowanie GraphPad). Zatwierdzenie badania. Zakup kasków buffy uzyskanych od anonimowych dawców krwi za pośrednictwem New York Blood Center został sprawdzony przez Institutional Review Board na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill i postanowił nie stanowić przedmiotu badań nad ludźmi. Podziękowania Dziękujemy firmie Liguo Zhang za dostarczenie przeciwciał anty-ludzkie BDCA2, Bruce Malcolm (Tibotec Inc.) za dostarczenie inhibitora proteazy HAV 3Cpro, Takahiro Masaki za pomoc w ilościowej mikroskopii oraz Lifang Ping i Will Lovell za pomoc techniczną. Praca ta była częściowo wspierana przez granty NIH U19-AI109965 i R01-AI103083 (do SM Lemon). Południowo-zachodnie Centrum Badań nad Prymatem jest wspierane przez grant NISZ dla ośrodków prymasowskich (wcześniej grant NCRR P51 RR13986, obecnie Urząd Programów Badań Infrastrukturalnych / OD P51 OD011133) oraz przez Program Udoskonalania Biur Badawczych udziela C06 RR 12087 i C06 RR016228 (do RE Lanford). Przypisy Uwaga dotycząca oceny tego rękopisu: Rękopisy autorstwa naukowców związanych z Uniwersytetem Duke, Uniwersytetem Karoliny Północnej w Chapel Hill, Duke-NUS i Instytutem Medycznym Sanford-Burnham są obsługiwane nie przez członków redakcji, lecz przez redaktorzy naukowi, którzy konsultują się z wybranymi zewnętrznymi redaktorami i recenzentami. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2015; 125 (1): 169. 176. doi: 10.1172 / JCI77527. Obecny adres Zongdiego Fenga brzmi: Centrum Szczepień i Odporności, Instytut Badawczy Ogólnopolskiego Szpitala Dziecięcego, Columbus, Ohio, USA.
[hasła pokrewne: objawy chorej tarczycy, olej z kiełków pszenicy, numer statystyczny choroby ]