apteka super pharm płock

System ten umożliwia wprowadzenie złożonych kombinatorycznych zmian genetycznych do komórek ssaków przez zakażenie ex vivo i in vivo pojedynczym wektorem. Zastosowanie lentiwirusowego dostarczania genu umożliwia transdukcję szerokiej gamy dzielących się i niepodzielnych komórek, a integracja prowirusa do genomu zapewnia dziedziczność wprowadzonych zmian genetycznych. Prezentujemy przykłady inżynierii nowotworów ex vivo i in vivo, aby wykazać, że ten system, gdy jest stosowany samodzielnie lub w połączeniu z genetycznymi podejściami do linii płciowej, zapewnia nową eksperymentalną moc genetyczną w hodowanych komórkach ssaków i myszach. Wyniki Generowanie złożonych lentiwirusów policistronowych za pomocą przybornika wektorowego MuLE. Aby móc szybko i systematycznie przeprowadzać kombinatoryczne eksperymenty genetyczne w hodowanych komórkach ssaków i tkankach myszy, zaprojektowaliśmy system genetyczny, który umożliwia generowanie złożonych lentiwirusowych wektorów dostarczających gen w bardzo elastyczny, szybki i przyjazny dla użytkownika sposób. Zbudowaliśmy zestaw narzędzi wektorów bloków strukturalnych, który pozwala na kombinatoryczną rekombinację wielu elementów genetycznych do rodziny lentiwirusowych wektorów dostarczających geny. Seria wektorów wejściowych zgodnych z 104 bramkami MultiSite (wektory wprowadzania MuLE, Tabele dodatkowe i 2, materiał uzupełniający dostępny w Internecie za pomocą tego artykułu; doi: 10.1172 / JCI79743DS1), które umożliwiają wygenerowanie kilku różnych rodzajów manipulacji genetycznych. Konwencjonalne klonowanie z użyciem enzymów restrykcyjnych stosuje się najpierw do klonowania insertów genetycznych poniżej wybranego promotora, a cały element genetyczny z insertem promotora jest flankowany przez specyficzne miejsca attL i attR (Figura 1A). Mule Wektory wejściowe można efektywnie rekombinować w nocnej reakcji za pomocą rekombinacji attL-attR z różnymi wektorami lentiwirusowymi docelowymi Gateway, które wygenerowaliśmy. Wybór różnych miejsc attL-attR zapewnia ukierunkowanie kierunkowe reakcji rekombinacji i pozwala na jednoczesne rekombinowanie wektorów docelowych 1, 2, 3 lub 4 z wektorem docelowym. Za pomocą tego układu można szybko wytworzyć złożone, wieloskładnikowe ssacze wektory ekspresyjne zawierające 2, 3, 4 lub 5 niezależnych elementów genetycznych (Figura 1B). Wektory MuLE można pakować w celu wytworzenia lentiwirusów amfotropowych lub ekotropowych, które można następnie stosować do infekcji hodowanych linii komórkowych, komórek pierwotnych ex vivo lub komórek w tkankach myszy in vivo (Figura 1C). Całą procedurę można ukończyć w ciągu 7 do 8 dni. Rysunek Przegląd eksperymentów inżynierii genetycznej z wykorzystaniem wektorów MuLE. (A) Klonowanie enzymem restrykcyjnym stosuje się do generowania wektorów MuLE Entry z pożądaną wstawką genetyczną klonowaną poniżej pożądanego promotora (P), przy czym cały element wstawki promotorowej jest otoczony przez odpowiednie miejsca attL-attR. (B) Schematyczne omówienie klonowania rekombinacyjnego opartego na Gateway . w wektorach wejściowych 2, 3 lub 4 Mule do lentiwirusowych wektorów docelowych w celu wygenerowania multistronowych wektorów ekspresyjnych luliwirusa MuLE. Przedstawiono specyficzne miejsca attL-attR, które pośredniczą w każdej rekombinacji. CMR, gen oporności na chloramfenikol; ccdB, gen toksyny ccdB. (C) Transfekcja komórek 293T plazmidem ekspresyjnym wektora MuLE razem z lentiwirusowym wektorem do pakowania (psPAX2) i wektorem kodującym albo amfoteryczne (MD2G), albo ekotropowe (pEco) białka otoczki wytwarza lentiwirusy MuLE do transdukcji hodowanych komórek lub do in vivo wstrzyknięcie do mysich tkanek. Wygenerowaliśmy wektory wejściowe zawierające 3 różne promotory polimerazy RNA (pol) II (CMV, SV40, SFFV) i miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) w celu wygenerowania elementów genetycznych pozwalających na konstytutywną nadekspresję cDNA (Figura 2A). Wektor wejściowy z promotorem CMV i miejscami loxP flankującymi MCS pozwala na warunkowe, warunkowe usuwanie wstawionych genów za pośrednictwem Cre (Figura 2A), a wektory Entry zawierające indukowalny doksycykliną (indukowalny DOX) promotor CMV / TO umożliwia indukowalną ekspresję genu (rysunek 2B)
[patrz też: odma prezna, active food supplements polska, nowotwór wątroby ]